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细胞内的物质运输系统实验步骤之运铁蛋白质运输!

信息分类:生命科学资讯  日期: 2012-9-12 17:27:31  作者:YIYI发布 

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细胞内的物质运输系统实验步骤之运铁蛋白质运输!

(三)蛋白质内胞作用二:运铁蛋白质(Transferrin;Tf-488)之运输
1. 取4×104个COS-7细胞至12-well plate的单一培养井(well)中,经隔夜培养约16~24小时。
2. 取出培养液,加入含有萤光标定的Tf (Tf-488;绿光),浓度为5 μg/μl,体积200μl至每一个培养井内,并置入摄氏4度的冰箱10分钟。
3. 将细胞自冰箱取出,立刻放入二氧化碳培养箱,温度摄氏37度,二氧化碳浓度5 %,30分钟,促使Tf能从细胞膜运送至高基氏体处。
4. 取出后,以PBS清洗一次,再以浓度4 % 的福马林进行固定15分钟。
5. 以 PBS 清洗一次,加入含有0.01 % Triton X-100、0.05 % SDS的清洁剂,静置15分钟,以增加细胞膜的通透性。
6. 以 PBS 清洗二次,加入含有saponin、BSA的阻断缓衝液,静置30分钟,以阻断抗原与抗体间非专一性的结合。
7. 取出阻断缓衝液后,加入含有抗高基氏体标示蛋白质Golgin-245的抗体(来自老鼠的单株抗体;一级抗体),静置30分钟。
8. 以PBS清洗四次,加入含有萤光标定的二级抗体(抗老鼠之免疫球蛋白;红光),以及 DNA 染剂 Hochest33258,静置30分钟。
9. 以 PBS 清洗四次,待自然风乾后,于载玻片上滴入封片液,进行封片。
10. 以萤光显微镜观察标示蛋白质在细胞内的分布情形。
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