PCR是应用一种由高温生存细菌的DNA合成酶
信息分类：生命科学资讯 作者:yiyi发布
DNA连锁合成反应
PCR是应用一种由高温生存细菌的DNA合成酶, Taq DNA Polymerase, 加上Primers及dNTPs, 再能控制温度循环的合成仪中, 先加热使原本之DNA由双股分成单股, 再降温至Primers可与单股DNA结合, 再升温至DNA合成酶能充分运作, 一段时间后, 又升温使DNA分为单股, 再降温使Primers结合,再升一点温使DNA合成酶能充分运作, 如此不断循环, 约20~30次之后, DNA就可将特定片段倍複製达数百万次, 如此用以侦测微量DNA或测DNA中有无特殊排序等, 应用十分广泛.
材料：
10X及1X PCR reaction buffer
8mM dNTP mix
Oligonucleotide PCR Primers (上行与下行二股)
DNA模子
5μ/μl Termus aquaticus DNA Polymerase (Taq Polymerase)
Mineral oil
a thermal cycler
方法：
1. 在微量离心管中加入：
10μl 10X PCR reaction buffer
10μl 8mM dNTP mix solution
10μl 10μM 上行(Upstream) PCR Primer
10μl 10μM 下行(Downstream) PCR Primer
59μL template DNA(1μg in nuclease free dH2O)
1μl Taq Polymerase(2.5μ/μl)
若体积因各项成分的浓度之故未达100μl 可以1X PCR buffer调整.
2. 加入100μl mineral oil(防止蒸发)
3. 设定thermal cycler, 使先加热至94℃, 使DNA分成单股, 2min.
4. 在设定DNA复合温度, 此温度随Primer之组成而不同. 大致可以下列经验公式推估：
Tm＝81.5＋16.6(logM)＋0.41(GC﹪)－(500/n)
其中n＝Primer的长度
M是缓冲液中的盐分浓度摩尔数(不计Mg++的浓度)
例如, NaCl浓度为0.04, Tris浓度为0.67, 则为：
0.04(NaCl)＋0.67×0.01(Tris)＝0.047M salt
若以25个bp的Primer而言, 其Tm为
Tm＝81.5＋16.6(log0.047)＋0.41(60)－(500/25)＝64
而通常复合温度为Tm＋22度＝66度. 但若一时未便估算, 则以55℃进行, 一般也可成功.
进行一分钟.
5. 再设定DNA合成温度75℃, 2min. 在2分钟时间, DNA至少可合成1,000bp.
6. 如此设定thermal cycler循环3~5过程3次.
7. 取出10μl(取在mineral oil下层液体部分), 以电泳检试结果.
以下将各有关材料参考资料列出供不时之需(一般均係向厂商直接採购时索取或调好者, 此处为若需自行调配时参考用)
＊8mM dNTP：将2mM之每种(共4种)dNTP溷入, 保存在-20℃.
＊Oligonucleotide PCR Primers：以dH2O调成10Um, 保存在-20℃.
＊10X PCR buffer：50mM KCl 100mM Tris.Cl, pH8.4
15mM MgCl2200μg/ml gelatin
＊Taq DNA polymerase：通常以5μ/μl浓度出售, 而使用时每100μl, 只要1.5~2.5μ即足, 故在使用前可以PCR buffer调整浓度. 此酶无proof reading功能, 亦未明显发现有exonuclease的功能. 最适宜的反应温度为75~80℃.
＊在PCR反应中, 下列条件必须注意：
1. 至少要有2μTaq polymerase/100μl reaction
2. 1.5mM之Mg+2/0.8mM dNTP mix
3. 100 Pmol each Oligonucleotide PCR Primers