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用于修饰DNA的酶与使用方法

信息分类:生命科学资讯  日期: 2011-12-18 14:50:18

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用于修饰DNA的酶与使用方法

酶应保存在-20℃冷柜中, 使用时取出放在0℃冰上, 酶的价格昂贵, 宜珍惜使用.

各种酶均有其特别的缓冲液. 通常均可在採购时向厂商索取.

The Klenow fragment:是E.Coli DNA PolymeraseI靠C端的部份,为删去由NH2端的323个胺基酸而成,具有DNA Polymerase与3'→5'exonuclease的功能. 以Klenow fragment来将含萤光标定的d NTP或放射性标定的d NTP加于DNA片段尾端, 可将约0.1~4μg由电泳中提纯的DNA, 加上萤光标定的d NTP, 再加上未标定的3 d NTPs, 再加上1U的Klenow fragment, 再加入适量buffer, 置30℃, 20min即可(其中d NTP的浓度在0.5mM). 此原理是利用限制酶切割后再经电泳提纯的DNA, 在二端均有 ----____单股部分, Klenow fragment会将d NTP加于单股处, 此时需注意的是所缺的单股若正好无可配标定d NTP的核甘酸则无法标定, 故应注意. 如以Ban HI切割的会有GATC排序, 若以Eco RI切割的则会有AATT排序, 此时若以有标定的GTP或CTP来标定则无效.

亦可採用Random Oligonucleotide-Primed synthesis方法来标定DNA, 其原理为:将DNA以某一限制酶切割, 再电泳, 取出所需的DNA片段, 加热使此双股DNA分为单股, 再将Random Oligonucleotide(通常为六个nucleotides)接上去, 再放入d NTPs即Klenow frament, 如此, 则DNA片段就会被标定了.

方法:

1. 在一个小型离心管中加入2.5μl之0.5mM 3dCTPs.

2. 再加入10X之Klenow fragment buffer, 2.5μl.

3. 加入欲标定之有标定dNTP, 1μl.

4. 再加入1μl之Klenow fragment.

5. 再以另一支离心管, 加入约0.03~0.1μg的DNA(想被标定的DNA), 及Random hexanucleotide(1μg), 再加入T.E. buffer使总体机为18μl, 将此离心管置沸水中3min, 再取出放冰上.

6. 将二支离心管物溷合, 置室温, 3hr, 反应即完成.

Taq DNA Polymerase之使用:

此酶係由Thermus aquaticus菌所分离出来, 它的最有效温度是在75~80℃, 它多被用于Polymerase Chain Reaction(PCR). 其使用方法在介绍PCR时再行介绍.

RNase亦有由不同来源分离出来者, 所切割RNA的位置亦不同, 但一般RNase均能在多种反应情况下产生作用, 且使用后若要除去它, 通常要加入Proteinase K, 再以Phenol extractions及ethanol precipitation处理.

DNA ligases:

用以接合单股有缺口的DNA或双股可交叉配合的DNA(即以限制酶切割所形成的 ----____ 交叉片段. 时下使用的ligase, 要ATP, E.Coli ligase要NAD为能源.

使用方法:

1. 在微量离心管中加入ligase缓冲液,再加入0.5mM ATP, 1μg DNA(即所需接合的DNA), 再加入1μ的T4 ligase, 置15℃, 2hr, 可成.

2. 若係二段钝端DNA接合(即无交叉片段之DNA), 则需10倍以上的酶方能达成. 有研究显示加入即为量的PEG8000可助ligase的功能.

运用ligase构建嫁接DNA分子:

1. 再将想构建的DNA片段经电泳幼提纯之后, 以下法进行:

2. 取0.1至5μg想接合构建的DNA放入微量离心管中(体积以9μl为准), 再加入10μl之2X ligase buffer, 再加入1μl之10mM ATP, 再加入20至500μ的T4 DNA ligase(以有交叉配对的DNA为准).

3. 置15℃, 3hr, 或隔夜, 可成.

4. 将此接合之嫁接媒介, 以基因转植方式, 植入E.Coli宿主, 并检查结果, 依marker表现情形可知有无正确的结果, 若有, 则将含此正确嫁接媒介的E.Coli加以培养, 再以提纯质体方式获取大量所要的嫁接媒介.

2X T4 DNA ligase buffer之配方为:

100mM Tris.Cl, pH7.5

 20Mm MgCl2

 20Mm DTT(dithiothreitol此物必须冷冻保存)

在构建嫁接媒介时, 必须考虑到它要能在宿主中能自行複製, 且能将所要的基因表现出来, 而且还能加上marker, 以便由marker之有无来检测构建之成功与否. 在使用ligase时, 常会有各种机率的结合, 而产生非所要的结果,亦有多段结合者, 但因皆与或然率有关, 理论上仍会出现若干所要的结果.

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