DNA-Protein交互作用的研究、细胞核物质抽提
信息分类：生命科学资讯 作者:yiyi发布
DNA-Protein交互作用的研究
许多基因功能控制受到与此基因中某一片断与某特殊蛋白质的结合之影响,
为研究此种关係而研发出一些技术. 要研究此一主题, 首先必须先进行细胞核与细胞质中物质的抽提.
细胞核物质抽提
材 料：
哺乳类动物细胞(可用组织培养细胞如Hela)
PBS
Hypotonic buffer
Low-salt buffer
High-salt buffer with 1.2M KCl
Dialysis buffer
Liquid nitrogen
玻璃製Dounce homogenizer
Dialysis membrane tubing (孔洞分子量≦14,000)
导电测量器
方 法： (此方法均再4℃进行)
1. 需用5~10×108cells/liter的组织培养细胞, 以250ml离心管, 离心20min, 4,000rpm. (若为monolayer细胞, 应以塑胶刮刀将细胞刮下放入离心管中, 细胞要先以PBS洗过在刮下.) 倒去上清.
2. 估计沉淀物之大略体积, 加入体积量5倍的PBS, 溷合后, 离心10min, 4,000rpm, 倒去上清.
3. 将沉淀细胞溶于hypotonic buffer(约沉淀体积5倍量), 离心5min, 4,000rpm, 倒去上清. 此一步骤动作要快, 以免细胞破裂损失抽提物质.
4. 加入原沉淀细胞体积3倍的hypotonic buffer, 置冰上10min, (此外原沉淀体积留在第二步骤时所得体积, 因在第三步骤时体积因细胞膨胀而增大了).
5. 将细胞倒入Dounce homogenizer, 上下压榨细胞(处理时, 动作轻, 以免伤及细胞核).
6. 将均质后的细胞倒入离心管, 离心15min, 4,500rpm, 分开保留上轻与沉淀物二者. 上清用于抽提细胞植物, 沉淀物用于抽提细胞核内物质.
7. 估计沉淀物体积, 加入约体积1/2倍的low-salt buffer, 然后一边搅拌, 一边一滴一滴加入high-salt buffer, 直到约1/2的沉淀物体积为止.
8. 缓缓振动, 30min, 再离心15,000rpm, 30min, 上清液就是核内粹取液.
9. 将粹取液放入透析膜内, 以50倍液透析, 直到可以导电器量出袋内外之导电度相同为止. (2ml以下量约1hr, 100ml约5hr)
10.取出粹取物, 离心15,000rpm, 20min, 保留上清. 用小量测蛋白质浓度, 其馀保存在-70℃.
接着将前述步骤6中的上清物, 用来提取细胞质粹取物.
材 料：
10x cytoplasmic extract buffer
方 法：
1. 取细胞质(上清液)量0.11倍体积的10x cytoplasmic extract buffer加入溷合.
2. 离心16,000rpm, 1hr, 将上清液倒入透析膜内, 至膜内外导电度相同为止.
3. 取出粹取物, 离心15,000rpm, 20min, 保留上清, 保存于-70℃.
配方：
10x cytoplasmic extract buffer：
0.3M HEPES, pH7.9, 4℃
1.4M KCl
0.03M MgCl2
Dialysis buffer：
20mM HEPES, pH7.9, 4℃
20﹪glycerol
0.2mM EDTA
0.2mM PMSF (phenyl methylsulfonyl fluoride)
※ 此化合物溶于isopropanol, 应先调0.2M的储存液备用, 在使用前才滴入.
0.5mM DTT (Dithiothreitol)
※ 必须使用前才加入.
High salt buffer：
20mM HEPES, pH7.9, 4℃
25﹪glycerol
1.5mM MgCl2
0.8, 0, 1.2, 1.4或1.6M KCl (用于测试何种浓度下可萃取最高量的物质, 若无足够时间, 取1.0或1.2M试之)
Hypotonic buffer：
10mM HEPES, pH7.9, 4℃
1.5mM MgCl2
10mM KCl
0.2mM PMSF (使用前加入)
0.2mM DTT (使用前加入)
Low salt buffer：
配方同high salt buffer, 而KCl用0.02M即可.
附注：
1. 以此方法测得结果约8mg/ml细胞蛋白质.
2. 做DNA-Protein交互作用研究, 方法为将核或细胞质提取之蛋白质与想研究的DNA片断结合, 并以电泳处理, 受结合的DNA会跑得慢. 另外, 亦可以Dnase I处理, 凡有结合的DNA不受切割, 方法很多, 容后再介绍.