酵母菌基因转植的方法和步骤？
信息分类：生命科学资讯 作者:yiyi发布
酵母菌基因转植
目前将基因转植入yeast中, 主要有电子枪, 电极, lithium acetate及spheroplasts等法, 此处仅介绍lithium acetate法. 此法是基于阳离子可使yeast的细胞膜能使DNA透过, 在加入DNA后, 再加入polyethylene glycol(PEG), 再涂在选择性的培养皿上.
材 料：
YPD medium
TE buffer
Lithium autate solution
5mg/ml carrier DNA (sheared E.Coli DNA)
PEG solution
含选择性化学品的培养皿
方 法：
1. 将纯化的单一菌群yeast加入2ml YPD液中, 在30℃成长一晚.
2. 将细胞稀释至OD600＝0.2(约3×106cells/ml)取50ml YPD(含上述量之yeast)于250锥形瓶中使长4hr, 30℃, 使达OD600＝0.5~1.0(约1~2×107cells/ml), (使用时约10ml可做一个实验).
3. 将细胞转入无菌离心管, 离心2,500rpm, 10min, 倒去上清, 将细胞溶在10ml的lithium acetate液中.
4. 再离心2,500rpm, 10min, 倒去上清, μl的lithium acetate液中.
5. 将细胞符悬液转入一支消毒过的13×100ml试管置30℃, 轻轻振盪50rpm, 1hr.
6. 将100μl的上述细胞浮悬液加入微量离心管中(一共可有5支), 除控制组那支外, 其馀各加入10μg的Donor DNA及20μg的carrier DNA(保总体积不要多于15μl). 对控制组则只加入carrier DNA, 将液体以pipettor上下抽吸溷合. 置30℃, 30min.
7. 每支试管加入0.7ml PEG液, 以手指轻弹试管溷合之, 置30℃, 45min, 再置42℃, 5min.
1. 将每试管内吸出200μl涂选择性平盘, 置30℃, 2天, 可看结果.
2. 将再选择性平盘上的分离菌种, 取数个, 分别培养于培养液中, 以便保存.
配方：
lithium acetate solution：
0.1M lithium acetate
10mM Tris.Cl, pH8.0
1mM EDTA
以过滤消毒
PEG solution：
40﹪(w/v) PEG3350
0.1M lithium acetate
10mM Tris Cl, pH8.0
1mM EDTA
过滤消毒
附注：
此种方法可得约每μg DNA, 有1~10个细胞可转植成功.