环境荷尔蒙和环境激素生物检测实验步骤

室温下，将上层澄清液吸出之后，加入1.5 mL之新鲜培养液(SD-His or SD-His-Ura)和1.5 mL含有30% glycerol 培养液(SD-His or SD-His-Ura)，与细胞混合均匀，分装至1 mL之微量离心管中(100 ul/vial)，并贴上标籤(标示菌种、培养液、保存日期、保存者、编号)。

将离心管置于保存盒内，先置放4℃冰箱保存约3小时，在放入-20℃冰箱储藏约3小时。最后再置于-80℃冰箱储藏。一般而言，酵母菌可置于含有15% glycerol培养液中，于-80℃下储藏长达5年。

酵母菌之再活化 (Strain revival)

1.将一包Medium( SD medium-His )，倒入500 mL之广口瓶中，加入350mL D.D. water，取出14 mL之培养液，加入6 mL即可(可得20 mL 30% glycerol)；其馀之培养液加入144 mL D.D. water，即为SD-medium-His；取SD-medium-His 200 mL加入4 g agarose和0.02g NaOH，即为SDA-medium-His。标示品名、配制者、日期、贴上灭菌带，灭菌。灭菌前需将盖子松开。

2.将灭完菌的SDA-medium-His，冷却至约50 ℃，即可将其倒入培养皿内，约六分满(15-20mL)，待乾后，盖好盖子，倒置，储存于4℃冰箱，即为新的培养皿。

3.欲重新活化酵母菌时，于酵母菌储藏瓶中，取少量上层解冻之酵母菌液，划在培养皿上，于30℃下培养3~4天，每隔一个月重划培养皿一次，将旧的培养皿灭菌后丢弃。

酵母菌细胞之制备

取培养盘上少许细胞，将其溶于3.0 mL SD medium-His培养液中，置于轨道震盪器(orbital shaker)上培养隔夜。

取100μL菌液，加上900μL培养液，以分光光度计波长600 nm (OD600)或显微镜测定，估算其细胞个数。

酵母菌细胞数之定量分析

1.将灭菌之培养液以分光光度计由波长360 nm至波长800 nm每隔20 nm读一次吸光值，观察此培养液在此波长范围内有无特殊之吸光值。

2.将培养PL3之酵母菌液亦以分光光度计由波长360 nm至波长800 nm每隔20 nm读一次吸光值观察此培养液在此波长范围内有无特殊之吸光值。

3. 在两种不同浓度菌液分别测其分光光度(OD600)，与进行显微镜观察。显微镜观察将菌液稀释至适当浓度范围内(颗粒计数器方格内酵母菌细胞数100个以内，超过100则稀释后重新计数)，混合均匀，在细胞计数器凹槽注入约10μL菌液，以显微镜接目镜20倍，接物镜20倍观察，凡是酵母菌落在细胞计数器方格线上一律不予计算，计算细胞计数器的方格中的细胞数，每一次以计算6个小方格，取其平均值及标準偏差。并且测其在波长600 nm下吸光值。

酵母菌液细胞个数与分光光度计吸光值线性动态范围

将培养24小时之酵母菌液，连续稀释测其吸光值，同时并以显微镜计数。

酵母菌生长曲线

于15 mL离心管中加入3 mL培养液(SD medium-His)，自培养皿上刮取少许酵母菌加入培养液中，混合均匀，置于orbital shaker上培养隔夜。

以绝对酒精配制100 ppb 的雌二醇、乙基雌二醇。

取50 m L绝对酒精、100 ppb雌二醇、100 ppb乙基雌二醇、绝对酒精至100 mL血清瓶中，各三重複。此试验雌二醇、乙基雌二醇最终浓度为500 ppb。

100 ppb雌二醇、100 ppb乙基雌二醇瓶等待酒精挥发至乾，各加入10 mL SD medium-His-Ura，而两份的绝对酒精，等待酒精挥发至乾，一份加入10 mL SD medium-His-Ura作为空白试验，另一份加入10 mL SD medium-His作为阳性控制组， 以121 ℃、15分钟灭菌，待冷却至室温。

将前一日培养的酵母菌，取移植至上述10 mL新鲜培养液，三重複。

于培养后，在第3、7、22、30、48、54小时取1 mL进行显微镜计数观察