gel block绝不可以任何有机溶剂处理
信息分类：生命科学资讯 作者:yiyi发布
做扫瞄比较(Gene Scan)用
使用Fluorescent Genotyping Demonstration Kits A(#402246)或B(#402247), Kit A可amplify PCR products, Kit B则用于业已经PCR amplified 之样本.
另须Fluorescent Amidite Matrix Standatds (#401546)
Deionized formamide
filter-sterilized deionied water
若用Kit B则尚须GeneScan-350 size standard(#401736)
ABI Prism 310 10x Genetic Analyzer buffer with EDTA (#402824)
POP-4(#402838)等材料.
在将机器由做排序转换为扫瞄用时, 须先将毛细管, gel block, 玻离针筒均洗淨, 重装. 并准备好1x之Genetic Analyzer buffer with EDTA 50ml.
注意：
gel block绝不可以任何有机溶剂处理. 全程须带手套. 充填gel方式同排序步骤, 只是gel为POP-4.
1. 由电脑中选About collection software, 由window中选Perferences, 再选Sequence injection list Default, 或GeneScan injection List default, 若电脑要求则输入139115, 按OK, 再选Collection Software一次.
2. 由Manual Control window之Function项, 选Syringe Home 按execute, 再由Function项中选Syringe Max travel, 记下所显示数据, 再按Syringe Down, 输入前项所显示数据, 按execute, 在针杆推进器与针杆相接时, 停止, 由window中选Status.
3. 在injection项下记下数据, 将此数据减15, 再选Syringe Max Travel, 将上述减去15之数据输入, 按execute, 将数据抄在仪器左侧门内.
4. 再选Syringe Up, 输入250, 按execute, ……其馀装毛细管, 装gel, 装样本方式均同做排序方式, 然后, 由Instrument项选change capillary, 在Reset项按OK, 使injection counter设为0. 再由Manual control中选temperature输入60℃, 按execute.
准备样本：
1. 准备14支0.5ml离心管, 分2列, 每列8支, 每列第7与第8支单独放, (简写为A1~A8, B1~B8)
2. 将Kit A置冰上解冻, 将第1列之A1~A6及第2列B1~B6各支中, 各加入9μl Reagent mix, 再加3μl之control DNA 1347-02于A1~A6中, 再于B1~B6中各加3μl Control DNA 1347-10.
3. 在A1,B1中各加3μl D12S83-[FAM].
4. 在A2,B2中各加3μl D7S517-[FAM].
5. 在A3,B3中各加3μl D2S391-[TET].
6. 在A4,B4中各加3μl D13S171-[TET].
7. 在A5,B5中各加3μl D1S220-[HEX].
8. 在A6,B6中各加3μl D3S266-[HEX].
9. 然后每支中各加40μl mineral oil, 盖好管盖, 离心1500rpm, 15sec.
10.再进行PCR, 95℃, 12min, 1 cycle.
11.再94℃, 15sec, 55℃, 15sec, 72℃, 30 sec, 10 cycles.
12.再89℃, 15 sec, 55℃, 15 sec, 72℃, 30sec, 20 cycles.
13.再final extention 72℃, 30min, 保存在4℃.
14.之后由A1, A2中各取7.5μl, A3, A4中各取5μl, A5, A6中各取10μl, 置入A7中.
15.同样将B1, B2中各取7.5μl, B3, B4中各取5μl, B5, B6中各取10μl, 置入B7中.
16.再由A7中取1μl置入A8, 由B7中取1μl置入B8. (若使用Kit B则各为2μl).
17.然后方子A8, B8中各加入formamide size standard mix 12μl. 将A8, B8离心1,000rpm, 15sec, 置95℃, 5min, 置冰上.
准备deionized formamide：
1. 50ml加5g ion-exchange formamide resin(AG501×8 from BioRad), 搅拌30min, 以试纸测pH若在7~9之间则可.
2. 将deionized formamide以2 micron滤器过滤, 分500μl保存-20℃. 若在7~9之间则可
3. 将formamide吸入另一加有5g ion-exchange之烧杯再搅拌30min, 以试纸测pH若在7~9之间则可, 分500μl保存.
准备formamide size standard mix：
1. 5μl size standard＋12μl deionized formamide, 缓速vortex 5sec, 离心1000rpm, 15sec, 保存于4℃.
准备Matrix standard samples：
1. 1μl matrix standard＋12μl deionized formamide, 缓速vortex 5sec, 离心1000rpm, 15sec, 保存于4℃.
Denature Matrix standard samples：
1. 将sample置95℃ 5min, 再置冰上待用.
2. 然后, 将上述样本依A7, A8, 及4种matrix standard samples分别置autosampler tray上的右起第1排之1~6位上. 而Kit B的样本置另一tray上排列方式比照.
3. 再准备Genescan sample sheet, 依Kit A或B分别设定, 再设定Genescan injection list, 机器会自动执行每样本1次, 若要多于1次, 要重覆设定, 在第1样本前, 加1行, 设定module为Test CCD4-color, 如排序时一样, 但collection time改为1min, 以测毛细管装置是否妥当, 若baseline值＜2,068则可. 再按Run则开始. 在run时, 可随时由电脑监看.
4. 设定GeneScan Matrix File方式与排序类同.
5. Run结束, 不论排序或Scan均要将玻璃针筒洗淨, 加dH2O 250μl, 关掉所有valves, 将Syringe drive移至250处, 然后run Seq Fill Capillary module, 使polymer洗淨, 约6min. 将毛细管取出两瑞插入含水离心管中保存.