肠病毒71型(EV 71, 2272 strain) 培养！
信息分类：生命科学资讯 作者:YIYI发布
肠病毒 71 型 (EV 71, 2272 strain) 培养
先以含 10% FBS-MEMα medium 于 15 cm 培养盘，并使之长成约 7~8
分满，吸除旧的培养液，再加入含 2% FBS-MEMα medium，并接种入 15 µl
EV 71，置于 5% CO2 之 37℃培养箱培养约 3 天后，连同培养液吸入 50 ml
离心管，以 3000 rpm 离心 10 分钟，吸取 1 ml 上清液分装，保存于-70℃冰
箱，以待测定每 1 ml 病毒液的半数组织培养感染剂量(TCID50/ml)。
四、半数组织培养感染剂量(Tissue culture infection dose, TCID50)
先将 RD cell 以 2 x 104
cell/well 培养至 96 well plate，将待测病毒先经
由 10 倍序列稀释后，加入 50 µl 稀释过的病毒液于 96 well plate，10
-3
~ 10
-10
(三重覆)，放入 5% CO2 之 37℃培养箱，3 天后取出 96 well plate，观察是否
有细胞病变(cytopathic effect, CPE)产生，并将之记录下来分别计算每 1 ml
病毒液有多少 TCID50。
五、FACScan 分析
将 RD cell 以 3 x 105
cell/well 培养至 6 well plate，放入 5% CO2 之 37℃
培养箱隔夜培养，吸掉旧培养基，添加不同浓度之穿心莲乙酸乙酯萃取物(50
~ 10 µg/ml)、纯化合物 1 ~ 12 (10 ~ 2.5 µg/ml)与 RD cell 预培养 2 小时，再
添加由 TCID50 实验求得之 EV 71 病毒液，共同培养 48 小时后，以显微静
观察 CPE 情形，并拍照记录之。
加入适量 trypsin 处理细胞，使其由 6 well plate 培养皿表面脱落，再添
加适量 2% FBS-MEMα medium 终止 trypsin 反应，以 3000 rpm 离心 5 分钟，
吸去上清液，加入 1 x PBS buffer，3000 rpm 离心 5 分钟，吸去上清液，加
入 methanol 于 4℃反应 30 分钟，3000 rpm 离心 5 分钟，吸去上清液，加入
1 x PBS buffer，3000 rpm 离心 5 分钟，吸去上清液，加入 RNAase A 于室温
下反应 10 分钟，再加入 PI (Propidium iodide, Sigma)，于冰上避光反应 15
分钟，以流式细胞仪 (FACScan, BD)收集细胞，并以 CellQuest 软体分析数
据