请问如何提取小鼠骨髓细胞?

1．条件培养基的制备：小鼠麻醉致死，全身浸泡于75％乙醇消毒，无菌取出腹膜，置于90mm塑料平皿中，加10mlα－MEM＋20％FBS，于37℃5％CO2孵箱内培养3天后，培基滤过除菌，－20℃冻存。此条件培养基中含粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

2．软琼脂培基制备：琼脂30mg置一试管中加蒸馏水3ml，103.4kPa高压灭菌，待冷却至50～60℃加2倍浓度的α－MEM，等量混合置42℃水浴中保温。

3．骨髓细胞的制备：小鼠经麻醉处死．消毒后，无菌取出左右两侧大腿骨，去除周围肌肉组织后放入35mm塑料培养皿中，切除两侧骨的端部，用吸有α－MEM培养液的注射器冲压出骨髓于一短试管中，用吸管吹打后放置5～10min，将悬浮的细胞移植到另一试管中。取细胞悬液0.1ml与Turk白细胞稀释液0.9ml混合，用血细胞计算板计数有核细胞数。根据计数，用a—MEM液将骨髓细胞浓度稀释成5×105个／ml。

4．细胞接种：取骨髓细胞悬液0.5ml，条件培养液0.5ml及胎牛血清1ml混合于小试管中，加软琼脂培养基3ml(42℃)，迅速混合后分注入4支35mm塑料培养皿中，每支1ml，使整个平皿底部铺平(此操作的动作要快，温度不能太低，注意琼脂不能在未分装前就固定于试管中)。静置5～10min，琼脂板可完全凝固，置37℃，5％CO2孵箱内培养7天。

5、显微镜观察与克隆计数：于低倍镜(40～100倍)的倒置显微镜或解剖显微镜下计数克隆数。通常由50个以上的细胞才形成一个克隆，并以克隆组成的形态而分类为集块型、扩散型和混合型。
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