环境污染物造成细胞染色体缺失的影响实验过程！

了解环境污染物造成细胞染色体缺失之影响。

(二) 仪器和药品

1.       离心机,倒立显微镜,光学显微镜

2.       甲醇,冰醋酸,乙醯胺秋水仙素,氯化钾,生理食盐水(PBS),缓衝溶液(Sorensen’s Buffer, SB),吉氏染剂(Giemsa)

(三) 实验原理

染色体存在于细胞核内，电子显微镜下观察，可发现它是由许多彼此相连的染色颗粒(chromomere)所组成。染色体内部的物质主要为遗传物质去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)，其次为一种碱性的核蛋白(histone)，二者组成一种複杂的化合物。细胞分裂时，染色体构造之型态与染色体的分离与，筱关细胞週期的正常进行，虽染色体增殖时，其形状大小亦随染色体构造上的异常可能会自然发生，但亦会由物理及化学因子诱导而产生，包括了缺失（deletion）、重複（duplication）、倒转（inversion）、异位（translocation）。染色体之异常常与许多遗传疾病及癌症相关，因此常用做测试污染毒性物质对细胞遗传毒性之指标。

(四)、实验流程

1.       种5 x105 cells/60mm Dish,106 cells/100mm Dish 于培养皿18小时

2.       加药Cadmium (0, 0.5, 1, 2 M )处理24hr后,换新鲜medium收细胞前2小时加入colcemid 0.2 g/ml,使细胞停在分裂中期(metaphase) colcemid: stock 50 g/ml in dil. H2O, dilute with PBS

3.       轻拍培养瓶,摇下细胞,将培养基倒入离心管

4.       以生理食盐水(PBS)洗一次,再将之倒入离心管

5.       离心800 rpm 4 min 200C

6.       再倒去上清液,轻拍管底以拍散细胞

7.       再以生理食盐水(PBS)洗培养瓶一次(同步骤5,6,7)

8.       加入5ml 0.5% KCl,静置6min

9.       离心800 rpm 4 min 200C, 再倒去上清液,轻拍管底以拍散细胞

10.   加入固定液(methanol:acetic acid=3:1,V/V *现配) 离心800 rpm 4 min 20 0C, 再倒去上清液

11.   重複步骤11, 2次,倒乾拍散

12.   再以固定液稀释细胞,悬浮液至适当浓度

13.   取一滴,滴在载玻片上

14.   风乾后,用3%吉氏染剂(Giemsa)染15分钟

15.   以蒸馏水去除染剂,风乾观察